提交凝膠切片進行蛋白質測定時，請注意角蛋白和其他雜質

質譜（MS）是一種基于質量差異表征和定量蛋白質的方法。當蛋白質在實驗室中無法解決時，研究人員通常會將從凝膠中切下的條帶提交給專門的MS設施進行蛋白質測定。然而，這項服務的價格為每5毫米凝膠切片180美元。重要的是要注意設施可能提交的任何指導方針或限制。為了獲得**大收益，我們收集了以下建議。 

避免角蛋白污染

當使用1D或2D凝膠/ MS和液相色譜（LC）/ MS平臺時，角蛋白污染是常見問題。角蛋白是一種天然存在的蛋白質，常見于指紋，頭發，死皮，羊毛衣物，DTT，β-巰基乙醇，緩沖劑和乳膠手套。在低濃度下，角蛋白不是問題。但是當角蛋白的濃度大于目標蛋白質時，角蛋白會壓倒MS系統。為盡量減少污染，請始終穿上實驗室外套并使用非乳膠手套。任何接觸凝膠或樣品的物質都可能是污染源。在澆鑄之前用70％乙醇徹底清洗所有板。避免將凝膠存放在保鮮膜中，并使用新的，干凈的塑料或玻璃凝膠托盤。將凝膠置于干凈的容器中，用70％乙醇或甲醇/乙腈徹底沖洗。在層流罩或其他清潔工作區域內進行整個凝膠內消化。沒有什么比提交樣本只是為了獲得無價值的數據 - 或者沒有數據 - 的回報更糟糕的了。

尋找胰蛋白酶

盡管每種樣品在各種MS平臺的制備，電離和檢測方面都有獨特的要求，但是存在一些適用于試劑的一般限制。胰蛋白酶消化產生不同分子量的肽用于MS分析，但胰蛋白酶的特異性值得注意。天然胰蛋白酶經歷自溶，產生假胰蛋白酶，其表現出更寬的特異性。在胰蛋白酶制劑中存在的自溶產物導致額外的肽片段，其可能阻礙正確的蛋白質鑒定。

注意染色限制

染色要求非常具體。確保蛋白質在染色過程中不會共價修飾或不可逆地固定在凝膠中。當通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質復合物的各個組分并通過銀（或考馬斯）染色顯現時，重要的是使用不含戊二醛的銀染方案。戊二醛化學修飾蛋白質并抑制后續步驟。對于低豐度蛋白質（通常需要通過銀染可見的那些），為了確保您的蛋白質存在于適當的檢測限度，通過在多個泳道（10μl**10μl）中運行樣品，將多個凝膠條帶組合起來是值得的?？偣?0μl）。對于SDS-凝膠樣品，如果可見帶有考馬斯藍染色的條帶（檢測限，100 ng），則可能存在足夠的材料用于蛋白質鑒定。污漬的檢測限也取決于諸如凝膠厚度和泳道寬度的變量。

仔細切除凝膠帶

在剪切任何樂隊之前拍攝圖像是個好主意。提交一份帶有樣本的副本，并指出切割帶的位置。切割感興趣的條帶時，每個樣品都應使用無菌剃刀刀片或手術刀。丙烯酰胺在MS分析中含有許多干擾劑，因此使其存在**小化。省略漫射染色邊緣并僅切除明顯染色的條帶。捕獲太少的凝膠意味著樣品的損失和太多的凝膠可能降低肽的產率。發現有一個很好的平衡?。∕S設施總是試圖引入產生有用光譜所需的**少量的材料。太多的樣品意味著更高的背景信號，需要停機時間進行清潔。）另外，不要將凝膠切碎，因為小塊很容易丟失。僅提交完整的樂隊。將每個凝膠帶放入單獨的干凈微量離心管中。不要使用任何帶O形圈或墊圈的管子。不要用封口膜或膠帶密封，因為它們也是角蛋白污染的常見來源。始終提交空白凝膠切片用作對照。將沒有任何液體的碎片存放在-20°C或-80°C的微量離心管中，直到您準備好提交您的皮帶。

提交凝膠切片后，MS設施提供的信息越多越好。請記住，純化的樣品總是**有可能進行陽性鑒定。分析純凈的低分子量有機化合物很容易; 混合物更難; 對高分子量化合物的復雜混合物進行綜合分析可能非常耗時。但如果您有截止日期，那么大規模設施將與您合作。畢竟，你是顧客！祝你好運。